Принцип эксперимента
Электрофорез гемоглобина направлен на обнаружение и подтверждение различных нормальных и аномальных гемоглобинов.
Из-за разных зарядов и изоэлектрических точек разных типов гемоглобина в буферном растворе с определенным pH, когда изоэлектрическая точка гемоглобина ниже, чем pH буферного раствора, гемоглобин несет отрицательный заряд и мигрирует к аноду во время электрофореза. И наоборот, гемоглобин с положительным зарядом движется к катоду.
При определенном напряжении и после определенного времени электрофореза гемоглобины с разными зарядами и молекулярными массами демонстрируют разные направления и скорости миграции. Это позволяет разделить отдельные зоны, и на этих зонах можно выполнить последующий колориметрический или электрофоретический сканирующий анализ для количественного определения различных гемоглобинов. Наиболее часто используемый метод - электрофорез на мембране ацетата целлюлозы с pH 8,6.
В цитоплазме группы этиленгликоля (СНОН-СНОН), присутствующие в гликогене или полисахаридных веществах (таких как мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины, гликолипиды и др.), окисляются иодной кислотой и превращаются в альдегидные группы (СНО-СНО). Эти альдегидные группы соединяются с бесцветным пурпурно-красным реагентом Шиффа, образуя пурпурно-красный краситель, который откладывается там, где в клетке присутствуют полисахариды. Эта реакция известна как периодическое кислотное окрашивание Шиффа (PAS), ранее называемое окрашиванием гликогена.
Метод эксперимента
Материалы:Ацетат целлюлозымембрана, аппарат для электрофореза(DYCP-38C и источник питания DYY-6C), Превосходный инструмент для загрузки образцов(пипетка), спектрофотометр, колориметрические кюветы, буферы.
Буфер:
(1) Буфер TEB с pH 8,6: взвесьте 10,29 г Триса, 0,6 г ЭДТА, 3,2 г борной кислоты и добавьте дистиллированную воду до 1000 мл.
(2) Боратный буфер: взвесьте 6,87 г буры и 5,56 г борной кислоты и добавьте дистиллированную воду до 1000 мл.
Процедура:
Pвосстановление раствора гемоглобина
Возьмите 3 мл крови, содержащей гепарин или цитрат натрия в качестве антикоагулянта. Центрифугируйте при 2000 об/мин в течение 10 минут и выбросьте плазму. Промывают эритроциты трижды физиологическим раствором (750 об/мин, центрифугирование по 5 минут каждый раз). Центрифугируйте при 2200 об/мин в течение 10 минут и отбросьте супернатант. Добавьте равное количество дистиллированной воды, затем добавьте 0,5-кратный объем четыреххлористого углерода. Энергично встряхивайте в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при 2200 об/мин в течение 10 минут, чтобы собрать раствор верхнего уровня гемоглобина для последующего использования.
Замачивание мембраны
Разрежьте мембрану из ацетата целлюлозы на полоски размером 3 см × 8 см. Замочите их в буфере TEB с pH 8,6 до полного насыщения, затем удалите и промокните фильтровальной бумагой.
Пятнистость
С помощью пипетки нанесите 10 мкл раствора гемоглобина вертикально на мембрану из ацетата целлюлозы (шершавая сторона), примерно в 1,5 см от края.
Электрофорез
Налейте боратный буферный раствор в камеру электрофореза. Поместите мембрану из ацетата целлюлозы пятнистой стороной к катодному концу камеры. Запустите при 200 В в течение 30 минут.
Элюирование
Вырежьте зоны HbA и HbA2, поместите их в отдельные пробирки и добавьте 15 мл и 3 мл дистиллированной воды соответственно. Аккуратно встряхните, чтобы полностью элюировать гемоглобин, затем перемешайте..
Колориметрия
Обнулите поглощение, используя дистиллированную воду для элюирующего раствора, и измерьте поглощение при 415 нм.
Расчет
HbA2(%) = поглощение пробирки HbA2 / (поглощение пробирки HbA × 5 + поглощение пробирки HbA2) × 100%
Результаты эксперимента. Расчет.
Референсный диапазон для электрофореза ацетата целлюлозы в буфере TEB с pH 8,6: HbA > 95%, HbA2 1–3,1%
Примечания
Время электрофореза не должно быть слишком продолжительным. Мембрана из ацетата целлюлозы не должна высыхать во время электрофореза. Прекратите электрофорез, когда HbA и HbA2 будут четко разделены. Длительный электрофорез может вызвать диффузию и размытие полос.
Избегайте использования слишком большого количества образца. Избыток жидкого гемоглобина может привести к отслоению полос или недостаточному окрашиванию, что приводит к ложно повышенному уровню HbA.
Предотвратите загрязнение мембраны из ацетата целлюлозы белками.
Ток не должен быть слишком большим; в противном случае полосы гемоглобина могут не разделиться.
Всегда включайте в качестве контроля образцы нормальных людей и необходимые известные аномальные гемоглобины.
Компания Beijing Liuyi Biotechnology производит профессиональный резервуар для электрофореза для электрофореза гемоглобина, который является модельюДYCP-38CБак для электрофореза с мембраной из ацетата целлюлозы, и для резервуара для электрофореза с мембраной из ацетата целлюлозы доступны две модели источника питания для электрофореза.ДYY-2CиДYY-6Cисточник питания.
Между тем, компания Beijing Liuyi Biotechnology предоставляет клиентам мембраны из ацетата целлюлозы, размер мембраны из ацетата целлюлозы может быть настроен по индивидуальному заказу. Добро пожаловать, чтобы попросить нас предоставить образцы и дополнительную информацию.
Бренд Beijing Liuyi имеет более чем 50-летнюю историю в Китае, и компания может предоставлять стабильную и высококачественную продукцию по всему миру. Благодаря многолетним разработкам он достоин вашего выбора!
Сейчас мы ищем партнеров, приветствуются как OEM-резервуары для электрофореза, так и дистрибьюторы.
Если у вас есть план закупок нашей продукции, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам. Вы можете отправить нам сообщение по электронной почте[электронная почта защищена]или[электронная почта защищена]или позвоните нам по телефону +86 15810650221 или добавьте WhatsApp +86 15810650221 или Wechat: 15810650221
Время публикации: 20 сентября 2023 г.